巴豆为大戟科植物巴豆(CrotontigliumL．)的干燥成熟种子，主产于我国西南及福建、湖北、湖南、广东、广西等地。性辛，热;有大毒，归胃、大肠经。内服泻下寒积、逐水消肿、祛痰利咽，外用蚀疮，可用于恶疮疥癣［1］。巴豆含脂肪油、蛋白质和生物碱等物质，其中巴豆总生物碱具显著的生理活性，具有抗癌抗肿瘤作用，如能诱导人肝癌SMMC-7721细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞等肿瘤细胞凋亡［2－3］。但目前尚未见巴豆中生物碱具体化学成分组成的相关报道，亦无有关巴豆中总生物碱含量测定方面的文献。已有研究表明木兰花碱具有抗炎、降压、抗生育等作用，可抑制α-葡萄糖苷酶活性［4］、抑制HERG钾通道蛋白的表达等［5］。本试验首次从巴豆中分离得到木兰花碱，并以木兰花碱为对照品，采用酸性染料比色法，首次建立了巴豆中总生物碱含量测定的方法，并比较了不同产地巴豆中总生物碱的含量，为巴豆药材的质量评价及巴豆总生物碱的开发利用提供依据。

1・仪器与试剂

Thermo紫外-可见分光光度计、SsrtoriusBSA224S-CW万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)、SsrtoriusCP225D十万分之一电子分析天平(广州市正一科技有限公司)。10批巴豆药材分别来源于四川、广西、云南3个主产区(详见表2)，经广州中医药大学赖小平研究员鉴定为大戟科植物巴豆CrotontigliumL．的果实。木兰花碱对照品(广州中医药大学新药开发研究中心提供，经HPLC法测定质量分数＞98%)。试验试剂均为分析纯，水为超纯水。

2・方法与结果

2．1溶液的制备

2．1．1对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的木兰花碱对照品4．91mg，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密吸取5mL，置50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.0491mg・mL－1的对照品溶液。

2．1．2供试品溶液的制备取干燥巴豆细粉2.5g，加乙醚索氏提取3h去油后，药渣用10倍量40%(体积分数)乙醇回流提取2次，每次40min，滤过，合并提取液，回收溶剂，定容至100mL容量瓶中，即得。

2．2酸性染料比色法条件的选择

2．2．1测定波长的选择精密吸取木兰花碱对照品溶液2．8mL及供试品溶液1．0mL，分别加入pH6．0磷酸缓冲液至8mL。分别加入溴麝香草酚蓝溶液3．5mL，三氯甲烷8mL，充分振摇3min后，静止40min后分取三氯甲烷液。另取磷酸缓冲液8mL，同法操作得三氯甲烷液，作为空白溶液，分别在200～600nm进行扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在420nm处均有稳定的最大吸收，空白溶液则无吸收，如图1所示，故选择420nm为测定波长。

2．2．2酸性染料用量的选择精密吸取木兰花碱对照品溶液助剂网2mL，共6份，分别置于不同的分液漏斗中，加入pH6．0磷酸缓冲液至8mL，分别加入配制好的溴麝香草酚蓝溶液2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5mL，其余按“2．2．1”项下同法操作。结果表明当溴麝香草酚蓝溶液加入量为3．5mL时吸光度最大，故选择溴麝香草酚蓝溶液的加入量为3．5mL。

2．2．3缓冲液pH的选择分别配制pH值为5．6、5．8、6．0、6．2、6．5、6．8的磷酸缓冲盐，精密吸取巴豆供试品溶液0．5mL、木兰花碱对照品溶液2mL，共6份，其余按照“2．2．1”项下操作，分别在420nm处测定吸光度。结果表明供试品和对照品溶液均在pH6．0缓冲液中吸光度值最大，故选用pH值为6.0的缓冲液。

2．2．4缓冲液用量的选择精密量取木兰花碱对照品溶液2mL，共7份，分别置于7个分液漏斗中，分别加入pH6．0磷酸缓冲液至6、7、8、9、10、11、12mL，再加入配制好的溴麝香草酚蓝溶液3．5mL，其余按“2．2．1”项下操作，结果表明加缓冲液至8～10mL时吸光度无明显变化，为节省溶剂，选择加入缓冲液至8mL。

2．3方法学考察

2．3．1标准曲线的制备精密吸取木兰花碱对照品液0．5、1．0、1．4、1．7、2．0、2．3、2．7、3．0mL，分别置于8个分液漏斗中，加pH值为6．0的磷酸缓冲液至8mL，其余操作按“2．2．1”项下进行。以对照品质量(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程助剂网:Y=4．6291X－0．0098(r=0.9995)，结果表明木兰花碱在0．0246～0．1473mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2．3．2精密度试验分别精密吸取已显色好的木兰花碱对照品溶液2mL，依法测定6次，吸光度的RSD值为0．61%，表明仪器精密度良好。

2．3．3稳定性试验精密吸取同一供试品(批号:20101122)溶液2mL，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h依法测定吸光值，结果RSD为0．76%，表明供试品溶液在3h内基本稳定。

2．3．4重复性试验精密称取同一批样品(批号:20101122)6份，各约2．5g，分别按“2．1．2”项下方法制备供试品溶液，按“2．2．1”项下方法测定吸光度，结果总生物碱平均质量分数为0．32%，RSD值为0．92%。

2．3．5加样回收率试验精密称取已知含量的同一批巴豆粉末(批号:20101122)约0．5g，精密称定，共6份，分别加入木兰花碱对照品溶液适量，分别按“2．1．2”项下方法制备供试品溶液。分别精确吸取2．5mL，各加入pH6．0磷酸缓冲液6mL，其余按“2．2．1”项下方法操作，在420nm处测定吸光度，结果见表1。平均回收率为99．0%，RSD为2．75%。

助剂网助剂网

2．4样品测定

取10批巴豆药材，每批平行操作3次，按“2．1．2”项下方法处理后依法测定，记录吸光度并计算质量分数，以木兰花碱计，结果见表2。结果显示，各产地巴豆总生物碱质量分数均有一定差异，最低值为0．22%，最高值为0.42%，平均值为0.33%。

3・讨论

除上述实验条件外，本文还对不同种类显色剂(溴酚蓝、溴甲酚绿、溴麝香草酚蓝)的显色效果进行了比较，结果发现只有溴麝香草酚蓝能与巴豆总生物碱较好地络合。同时对比色方法中的静置时间也做了考察，结果发现静置时间太短易产生混浊，太长则易受其他因素干扰而影响实验结果，实验结果表明，当静置时间在0．5～1．0h内符合要求，40min则可取得较理想的效果。

鉴于巴豆中生物碱类化学成分尚不明确，因此，研究中比较了木兰花碱与巴豆中提取的总生物碱样品的紫外可见光吸收特征，它们的吸收图谱基本一致，在420nm处均有最大吸收峰，故本文选用木兰花碱为对照品，间接地反映了巴豆中总生物碱的含量。有关巴豆中生物碱类物质的化学成分，尚在进一步研究中。

本文采用酸性染料比色法测定总生物碱的质量分数，原理是有机生物碱类物质在一定pH的介质中，可与某些酸性染料定量结合成有色络合物，该有色络合物可定量被有机溶剂提取，因此可用于测定有机碱的含量。本方法简便、快速、测定结果准确，可用于巴豆总生物碱的含量测定，对巴豆药材质量标准的提高及巴豆总生物碱的开发利用具有参考价值。

参考文献:

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010年版一部［M］．北京:中国医药科技出版社，2010:74．

［2］陈武，陈鹏英，刘鹏，等．巴豆生物碱对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及Bax，Bcl-2蛋白表达的影响［J］．中华中医药学刊，2009，27(7):1450－1452．

［3］王明艳，瞿融，许冬青．巴豆生物碱诱导人胃腺癌SGC－7901细胞凋亡的研究［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(11):119－201．

［4］瞿庆喜，朱庆亚，喻凯，等．凹叶厚朴中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分［J］．应用与环境生物学报，2009，15(6):796－798．

［5］沈国平，龙启福．木兰花碱对HERG钾通道蛋白表达的影响［J］．山东医药，2011，51(31):36－37．